Produkter

For specifikt at kvantificere flere metabolitter af 5-fluorouracil (5-FU) og to endogene monophosphatnukleotider udviklede vi en original metode baseret på en væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS).Denne analyse gjorde det muligt at bestemme: (i) den intracellulære produktion af 5-fluor-2'-deoxyuridin-5'-monophosphat (5-FdUMP) fra 5-FU eller 5-fluor-2'-deoxyuridin (5-FdUrd) , (ii) indvirkningen af ​​5-FdUMP-koncentration på det intracellulære 2'-deoxyuridin-5'-monophosphat (dUMP)/thymidin-5'-monophosphat (TMP) forholdet, og (iii) sekretionsgraden af ​​5-FdUMP og 5-FU fra humane dyrkede celler af ABC-transportører.Under vores eksperimentelle betingelser blev celler inkuberet med 5-FU eller 5-FUrd.Derefter blev cellulære proteiner præcipiteret med methanol.Denne procedure gav høj ekstraktionsgenvinding.For at måle 5-FU og 5-FdUMP sekretion fra celler udførte vi desuden kvantificering af disse molekyler i dyrkningsmedium.Medier blev enten direkte injiceret (5-FU) eller under en fastfaseekstraktion under anvendelse af Oasis Wax ekstraktionspatron (5-FdUMP).Separation af analytter blev udført på en dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm × 2,1 mm id) søjle med isokratisk tilstand under anvendelse af ammoniumformiatbuffer/methanol/vand (5/5/90, v/v) som mobil fase.Køretiden oversteg ikke 6,2 min.Analytterne blev ioniseret i en elektrospray-grænseflade under negativ ion-tilstand.Vi validerede metoden over et område på 2,5-150 ng mL -1 ifølge forbindelserne.Variabiliteten intra- og interassay var lavere end 10 % over syv dage.Alle forbindelser var stabile i celler eller i dyrkningsmedium, når prøver blev opbevaret ved -20 °C i mindst to uger og efter tre fryse-tø-cyklusser.Der blev ikke observeret nogen matrixeffekt i begge medier.