Produkter

Ny højtydende væskekromatografianalyse for glycosyltransferaser baseret på derivatisering med anthranilsyre og fluorescensdetektion.

Assays blev udviklet under anvendelse af den unikke mærkningskemi af 2-aminobenzoesyre (2AA; anthranilsyre, AA) til måling af aktiviteter af både β1-4 galactosyltransferase (GalT-1) og α2-6 sialyltransferase (ST-6) ved hjælp af højtydende væske kromatografi (HPLC) med fluorescensdetektion (Anumula KR. 2006. Fremskridt inden for fluorescensderivatiseringsmetoder til højtydende væskekromatografisk analyse af glycoproteinkulhydrater. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetylglucosamin (GlcNAc) og N-acetyllactosamin blev brugt som acceptorer og uridin-diphosphat (UDP)-galactose og cytidinmonophosphat (CMP)-N-acetylneuraminsyre (NANA) som donorer for henholdsvis GalT-1 og ST-6.Enzymatiske produkter blev mærket in situ med AA og blev separeret fra substraterne på TSKgel Amide 80 søjle under anvendelse af normalfase-betingelser.Enzymenheder blev bestemt ud fra toparealerne ved sammenligning med de samtidig derivatiserede standarder Gal-β1-4GlcNAc og NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Linearitet (tid og enzymkoncentration), præcision (intra- og interassay) og reproducerbarhed for assays blev etableret.Assayene viste sig at være nyttige til overvågning af enzymaktiviteterne under isolering og oprensning.Analyserne var meget følsomme og udførte lig med eller bedre end de traditionelle radioaktive sukkerbaserede målinger.Assayformatet kan også bruges til at måle aktiviteten af ​​andre transferaser, forudsat at kulhydratacceptorerne indeholder en reducerende ende til mærkning.Et assay for glycoproteinacceptorer blev udviklet under anvendelse af IgG.En kort HPLC-profileringsmetode blev udviklet til adskillelse af IgG-glycaner (biantennær G0, G1, G2, mono- og disialyleret), hvilket lettede bestemmelsen af ​​GalT-1- og ST-6-aktiviteter på en hurtig måde.Desuden skulle denne profileringsmetode vise sig nyttig til at overvåge ændringerne i IgG-glykaner i kliniske omgivelser.