Produkter

Eukaryote celler indeholder en delikat balance af små mængder af de fire deoxyribonukleosidtrifosfater (dNTP'er), der kun er tilstrækkelige til et par minutters DNA-replikation.Både en mangel og et overskud af en enkelt dNTP kan resultere i øgede mutationshastigheder, fejlagtig DNA-reparation eller mitokondriel DNA-udtømning.dNTP'er kvantificeres sædvanligvis ved et enzymatisk assay, hvor inkorporering af radioaktivt dATP (eller radioaktivt dTTP i assayet for dATP) i specifikke syntetiske oligonukleotider af en DNA-polymerase er proportional med koncentrationen af ​​det ukendte dNTP.Vi finder ud af, at den almindeligt anvendte Klenow DNA-polymerase kan erstatte det tilsvarende ribonukleotid med det ukendte dNTP, hvilket i nogle tilfælde fører til en stor overvurdering af dNTP'er.Vi beskriver nu assaybetingelser for hver dNTP, der undgår ribonukleotidinkorporering.For dTTP- og dATP-assays er det tilstrækkeligt at minimere koncentrationerne af Klenow-enzymet og af mærket dATP (eller dTTP);for dCTP og dGTP var vi nødt til at erstatte Klenow-enzymet med enten Taq DNA-polymerase eller Thermo Sequenase.Vi foreslår, at i nogle tidligere rapporter kan inkorporering af ribonukleotid have forårsaget for høje værdier for dGTP og dCTP.