Produkter

Den måde, hvorpå virkninger af samtidige mutationer kombineres for at ændre enzymatisk aktivitet, er ikke let forudsigelig, fordi disse virkninger ikke altid er additive på en lineær måde.Derfor kan karakteriseringen af ​​virkningerne af samtidige mutationer af aminosyrerester, der binder substratet, yde et væsentligt bidrag til forståelsen af ​​substratspecificiteten af ​​enzymer.I beta-glycosidasen fra Spodoptera frugiperda (Sfbetagly) interagerer både resterne Q39 og E451 med substratet, og dette er essentielt for at definere substratspecificitet.Dobbeltmutanter af Sfbetagly (A451E39, S451E39 og S451N39) blev fremstillet ved stedrettet mutagenese, udtrykt i bakterier og oprenset ved anvendelse af affinitetschromatografi.Disse enzymer blev karakteriseret under anvendelse af p-nitrophenyl beta-galactosid og p-nitrophenyl beta-fucosid som substrater.K kat/Km-forholdet for enkelt- og dobbeltmutanter af Sfbetagly-holdige stedsrettede mutationer i positionerne Q39 og E451 blev brugt til at demonstrere, at virkningen på den frie energi af ESdouble dolk (enzym-overgangstilstandskompleks) af dobbeltmutationerne (Gdouble) daggerxy) er ikke summen af ​​virkningerne som følge af de enkelte mutationer (Gdouble daggerx og Gdouble daggery).Denne forskel i Gdouble dolk indikerer, at virkningerne af de enkelte mutationer delvist overlapper hinanden.Derfor tæller denne fælles effekt kun én gang i Gdouble daggerxy.Krystallografiske data på beta-glycosidaser afslører tilstedeværelsen af ​​en bidentat hydrogenbinding, der involverer resterne Q39 og E451 og den samme hydroxylgruppe i substratet.Derfor tyder både termodynamiske og krystallografiske data på, at resterne Q39 og E451 udøver en gensidig indflydelse på deres respektive interaktioner med substratet.